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一种新型细胞划痕实验方法的简要介绍
点击次数:5382 发布日期:2019-3-4  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
 
一.传统细胞迁移实验技术—划痕实验
1.基本原理
细胞划痕(修复)法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上, 用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间(例如72h),取出细胞培养板,观察周边细胞是否生长(修复)至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力,实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力,可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

 
实验材料 细胞样品
试剂、试剂盒 无血清培养基 PBS
仪器、耗材 6孔板 maker 直尺 枪头
实验步骤
  • 准备:
    所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔等在操作前,需紫外照射30min(超净台内)
  • 流程
1.先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔0.5-1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2.在空中加入约5X105个细胞,具体数量因细胞不同而不同,掌握为过夜能铺满。
3.第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。
4.用PBS洗细胞3次,去处划下的细胞,加入无血清培养基。
5.放入37度5%CO2培养箱,培养。按0,6,12,24小时取样,拍照。

2、操作步骤
(1)先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 
(2)在孔中加入约5×105个细胞,具体数量因细胞种类不同而不同,接种原则为过夜后融合率达到100%。
(3)第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。
(4)PBS洗细胞3次,去处划下的细胞,加入无血清培养基。
(5)放入37℃ 5% CO2培养箱,培养。可按0,6,12,24h时间点取样,拍照(具体时间依实验需要而定)。
(6)统计方法:使用Image J软件打开图片后,随机划取6至8条水平线,计算细胞间距离的均值。
 

3.注意事项:
(1)在用PBS缓冲液冲洗时,贴壁慢慢加入,以免冲散单层贴壁细胞,影响实验拍照结果。
(2)一般做划痕实验,都是无血清或者低血清(<2%)否则细胞增殖就不能忽略。
(3)按照6孔板背后画线的垂直方向划痕,可以形成若干交叉点,作为固定的检测点,以解决了前后观察时位置不固定的问题。
二.传统实验方法主要问题
传统实验方法缺点是细胞增殖对实验结果有影响,即使在无血清或低血清条件时,细胞的状
态、代谢等方面会受到影响,由于细胞内信号传导系统整体性的下调,细胞迁移的速度也会
慢很多;另外创建“伤口”也可能时大时小,边缘不整齐等误差;还有在镜下拍照观察时,
每次观察点基本不可能做到完全一致等。
 
三.最新实验解决方法-------伤口愈合划痕插件
 



可黏附底部;生物相容硅胶材料;9 mm x 9 mm x 5 mm;两孔(70μl/孔);每孔生长面积0.22 cm2;可产生500 μm宽的“gap”  

特点:
1。 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。
2. 非常适合研究细胞与胞外基质(ECM),细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。
3。 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容,可用于分析细胞间的相互作用。
4。 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
 
细胞培养插件方法与传统划痕实验比较
细胞培养插件提供重复性更好的实验结果:
左图是伤口愈合插件做出的实验数据统计;右图是枪头划痕做出的实验数据统计

四.方案小结
1) 新型细胞划痕实验方法可以保证划痕的标准化,保证了实验的重复性-对比枪头划痕,划痕会歪歪扭扭,无法保证每次都一样; 
(2)新型细胞划痕实验方法可以避免枪头划痕会伤到包被;手动划痕伤到包被的话,会直接影响了细胞迁移的结果;
(3)直接镜检观察,成像效果良好; 
(4)新型细胞划痕实验方法有配套的图像分析,图像分析是通过计算实验区域的空白面积来计算愈合情况的,比分析计算的要更客观准确;
(5)产品用法简介: 只需要在插件的两个孔里种细胞,等细胞贴壁了再拔掉这个插件,细胞之间就会留下一道标准的划痕,就可以开始定时观察细胞愈合的情况了;
(6)多种规格适合不同的实验流程,2孔,3孔,4孔,带培养皿或者插件,细胞追踪实验专用插件培养皿等
来源:安徽11选5广州科适特科学仪器有限公司
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